เจ้าคุณพี่กับอีนางคำดวง เป็นละครพีเรียด ย้อนไปในต้นสมัยรัชกาลที่ 5 กับเรื่องราวของ "อีนางคำดวง" (เบลล่า ราณี) ที่ต้องมาเป็นนายฮ้อยแทนพ่อ ในการนำขบวนฝูงควายจากภาคอีสาน มาส่งยังหัวเมืองภาคตะวันออก อีนางคำดวง เป็นคนที่แข็งแรง ดุดัน เป็นนายฮ้อยผู้หญิงที่ปราบโจรจนกลัวหัดหด ทางด้าน ขุนเอกอิทธิฤทธิ์ หรือ ขุนเอก (เจมส์ จิรายุ) เป็นข้าราชการหนุ่ม ลูกพระยาจำรุณ เจ้าเมืองทุ่งใหญ่ ที่ได้รับคัดเลือกให้เป็นผู้เจรจาซื้ออาวุธปืนจากฝรั่ง แต่มีเหตุขัดแย้งกัน และมีเหตุการณ์จำเป็น ที่ต้องหาภรรยาจำเป็นมาเพื่อจะได้ทำหน้าที่เจรจาต่อ ป้องกันไม่ให้ถูกฉ้อโกง จนเป็นเหตุให้ "อีนางคำดวง" ต้องมาช่วยเหลือ และปลอมตัวเป็นสาวบางกอก